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用淋巴細胞分離液分離單個核細胞

1）分離外周血中的單個核細胞（PBMC）

1．抽取正常人靜脈血加到肝素抗凝管中，加等量含5～10IU/ml肝素的無血清緩沖液懸浮細胞。將細胞懸液小心加在與血液等量的淋巴細胞分離液上，室溫中，水平離心500×g 20分鐘。此時離心管中形成5層：zui上面是血漿，血漿層和淋巴細胞分離液之間是PBMC，淋巴細胞分離液層和zui下面的紅細胞層之間是粒細胞層，又成為棕黃層。

2．吸去zui上層的血漿，收集血漿層和淋巴細胞分離液交界面的單個核細胞，盡量全部吸出PBMC。加1～2倍量含5IU/ml肝素、2％滅活小牛血清的Hanks液（洗滌液），混勻后離心200×g 10分鐘，低速離心有利于去除細胞懸液中留存的血小板，去上清液。

3．再用同樣洗滌液洗滌細胞2次，每次離心500×g 10分鐘，洗去殘留的淋巴細胞分離液。用1％臺盼藍染色檢測細胞活力（應>95％）并計數(shù)細胞。再用含10％小牛血清的細胞培養(yǎng)液將細胞配成適當濃度。通常，每毫升外周血可得1×10⁶～2×10⁶PBMC。

2）分離關節(jié)滑液中的單個核細胞

1．將關節(jié)滑液置含肝素（終濃度5IU/ml）的離心管中，離心1000×g 15分鐘。

2．用含2％滅活小牛血清的Hanks液懸浮沉淀細胞并洗滌細胞1次，每次離心1000×g 15分鐘。用含2％滅活小牛血清的Hanks液懸浮細胞至原容量。

3．用淋巴細胞分離液分離關節(jié)滑液中的單個核細胞，并用含10％小牛血清的細胞培養(yǎng)液將細胞配成適當濃度。

3）分離組織中的單個核細胞

1．取外科分離的各種組織，用含1％慶大霉素和1％小牛血清的MEM培養(yǎng)液洗滌組織塊，洗去可能的污染物。將組織塊置培養(yǎng)皿中，加入約為組織塊體積510倍的同樣MEM培養(yǎng)液。用無菌外科剪刀將組織塊剪碎成0.5mm³大小。

2．將組織塊轉移到小培養(yǎng)瓶中，靜置片刻，吸去培養(yǎng)液。加入約2倍組織塊體積的、濾過除菌的酶溶液。37℃水浴搖床中消化1～2小時，注意組織塊的消化程度。

3．當組織塊消化分散后，用手用力搖晃培養(yǎng)瓶3～5分鐘或用大口吸管反復吹打，使細胞團進一步分散。加入30ml上述MEM培養(yǎng)液，終止酶反應。

4．讓上述懸液通過200目的金屬網或尼龍網，分離單個細胞。用上述MEM培養(yǎng)液洗滌細胞3次，每次離心1000×g 10分鐘。用1％臺盼藍染色法檢測細胞活力并計數(shù)細胞。

5．如果細胞量較多（>10⁷），應當用上述淋巴細胞分離液分離出單個核細胞，并用含10％小牛血清的細胞培養(yǎng)液將細胞配成適當濃度。

4）從小鼠胸腺中分離胸腺細胞

1．脫臼或剪頭處死小鼠，置75％乙醇中浸泡消毒。腹面向上固定，剪開小鼠胸腔，暴露和摘取胸腺。在平皿中用Hanks液洗凈血液，去除結締組織。

2．在有少量細胞培養(yǎng)液的平皿中，用鑷子梳理胸腺，再用大口吸管反復吹打，分離單個細胞。離心沉淀細胞，用細胞培養(yǎng)液洗滌細胞1次。加入適量細胞培養(yǎng)液，靜置5分鐘，讓大的組織塊自然沉降，吸出單個胸腺細胞。

3．用1％臺盼藍染色法檢測細胞活力，計數(shù)細胞。再用含10％小牛血清的細胞培養(yǎng)液將細胞配成適當濃度。