| 試劑盒組分： | Catalog # | PD1222-01 | | Preps | 50 | | ezBind Columns | 50 | | Buffer A1 | 25 mL | | Buffer B1 | 25 mL | | Buffer N3 | 5 mL | | Buffer KB | 30 mL | | Buffer RET | 50 mL | | DNA Wash Buffer* | 15 mL | | Endofree Elution Buffer | 10 mL | | RNase A（20 mg/mL） | 2.5 mg（175 µL） | | User Manual | 1 | 保存條件： RNAse A在4℃下可以保存一年，Buffer A1加入RNase A 后4℃保存，其它組分室溫保存。 注意事項(xiàng)： - 質(zhì)粒拷貝數(shù): 純化中低拷貝的質(zhì)粒時(shí)，使用2倍的菌液體積，2倍的Buffer A1, B1, N3, RET, 100% ethonal 相同體積的Wash Buffer和Endofree Elution Buffer.
- 轉(zhuǎn)化菌: 若為-70oC甘油凍存的菌，請(qǐng)先涂布平板培養(yǎng)后，再重新挑選新的單個(gè)菌落進(jìn)行培養(yǎng)。
- 切勿直接取凍存的菌進(jìn)行培養(yǎng)。
操作簡(jiǎn)明步驟： - 接種新鮮的單個(gè)菌落到3-12 mL的LB培養(yǎng)基 （含適量抗生素），37oC震蕩培養(yǎng)14-16小時(shí)。
- 室溫下13,000 rpm 離心1分鐘，收集菌體，并盡可能的吸去上清。
- 加入450 µL Buffer A1 （確保已加入RNase A） ，用移液器或渦流震蕩確保細(xì)菌沉淀重新懸浮。
- 加入 450 µL Buffer B1, 輕輕地反轉(zhuǎn)5-10 次以混合均勻，然后靜置2-5分鐘至溶液粘稠而澄清。
- 加入預(yù)冷的80 µL Buffer N3（或加入到裂解液后在冰上放置1分鐘將有利于減少蛋白漂浮）, 立即反轉(zhuǎn)5次，用手用力搖晃3-5次充分混勻，此時(shí)出現(xiàn)白色絮狀沉淀。
- 將離心管轉(zhuǎn)至高速離心機(jī)，在室溫下13,000 rpm離心10分鐘（若上清中仍有白色沉淀，可再次離心）。
- 定量吸取離心后的上清液至新的1.5 mL管中，加入1倍體積的Buffer RET, （如900 µL裂解液加入到900 µL的上清液）及400 µL的100% ethonal，充分顛倒混勻。
- 將溶液700 µL轉(zhuǎn)移至帶有收集管的DNA柱中，室溫下13,000 rpm 離心20秒，倒掉收集管中的廢液，將離心柱重新放回到收集管中。重復(fù)此步驟至全部溶液轉(zhuǎn)移至DNA柱中。
- 可選: 向DNA柱中加入 500 µL Buffer KB, 室溫下13,000 rpm 離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將離心柱重新放回到收集管中。
- 向離心柱中加入500 µL DNA Wash Buffer（確保已加入無(wú)水乙醇），室溫下，13,000 rpm 離心20秒，倒掉收集管中的廢液，將離心柱重新放回到收集管中。重復(fù)步驟“10”。
- 將離心柱放回高速離心機(jī)中，13,000 rpm室溫下開蓋離心2分鐘，以*去除殘留的乙醇。
- 將離心柱轉(zhuǎn)至一個(gè)新的1.5 mL離心管中，向DNA柱的正中間加入50~100 µL（體積>50 µL）的Endofree Elution Buffer，室溫放置1分鐘，13,000 rpm 離心1分鐘，洗脫質(zhì)粒DNA。將離心管中的洗脫液再次加到DNA柱的正中間，室溫放置1分鐘，13,000 rpm 離心1分鐘，收集洗脫液到同一個(gè)離心管中。
操作流程：  |
更新時(shí)間：2013-01-07 
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