| 從150～250 mL菌液中純化500～1200 μg無內毒素質粒DNA 試劑盒組分： | Catalog # | PD1515-00 | PD1515-01 | PD1515-02 | | Preps | 2 | 10 | 25 | | ezBindTM Columns | 2 | 10 | 25 | | Filter syringe （60 mL） | 2 | 10 | 25 | | Buffer A1 | 22 mL | 110 mL | 270 mL | | Buffer B1 | 22 mL | 110 mL | 270 mL | | Buffer N3 | 32 mL | 160 mL | 400 mL | | RNase A （20 mg/mL） | 2.2 mg （110 µL） | 11 mg （550 µL） | 27 mg （1.35 µL） | | EndoClean Buffer | 5 mL | 25 mL | 60 mL | | Endofree Elution Buffer | 5 mL | 25 mL | 60 mL | | User Manual | 1 | 1 | 1 | 保存條件： RNAse A在4℃下可以保存一年，Buffer A1加入RNase A 后4℃保存，其它組分室溫保存。 注意事項： - 質粒拷貝數：純化中低拷貝的質粒時，使用2倍的菌液體積，2倍的Buffer A1,B1,N3,100%乙醇，相同體積的70% 乙醇和Endofree Elution Buffer。
- 轉化菌: 若為-70oC甘油凍存的菌，請先涂布平板培養后，再重新挑選新的單個菌落進行培養。切勿直接取凍存在4oC的菌進行培養。
- 柱結合能力：1 mg
- 對富含內源核酸酶的宿主菌（endA＋）如HB101, JM101, TG1等，需去核酸酶，請使用產品PD1713。
操作簡明步驟： - 取100 µL新鮮的菌液接種到150-200 mL （勿超過 200 mL）的LB培養基（含適量抗生素），37oC震蕩培養14-16小時。室溫下5,000 x g離心10分鐘，收集菌體，并盡可能的吸去上清。
- 加入10 mL Buffer A1（確保已加入RNase A），用移液器或渦流震蕩確保菌體充分懸浮。
- 加入 10 mL Buffer B1, 輕輕地反轉5-10 次以混合均勻，然后靜置2-5分鐘至溶液粘稠而澄清。
- 加入2 mL Buffer N3, 立即反轉5次，用力搖晃3-5次充分混勻，此時出現白色絮狀沉淀。
- 將裂解液轉移至過濾器中，放在一個50mL的試管上靜置10分鐘。管中的白色絮狀沉淀浮上來，對準50 mL的管向下壓，使裂解液盡可能多的通過，有些裂解液可能會殘留在沉淀中。注：靜置10 分鐘時RNase A將工作，排除RNA污染。若離心十分鐘后再用過濾器過濾更有利于去除蛋白。
- 定量吸取離心后的上清液至新的50mL管中（避免吸起沉淀），加入0.1 倍體積的EndoClean Buffer，混勻后冰浴10分鐘，其間不時搖勻（若EndoClean Buffer粘稠難吸，可將槍頭剪掉頭后再吸取）。
- 取出后65oC溫浴5min，室溫下（務必使溶液溫度恢復到23oC以上，否則溶液不分層）12,000 x g離心10分鐘（也可在2,500 x g離心15 min）。此時溶液分為兩層，上層水相含有質粒，下層紅色有機相含有內毒素。
- 將上層水相轉移至一個新的50 mL管中，加入10 mL的Buffer N3及12 mL的100% ethonal，用手用力甩5次以混勻，需馬上離心過DNA柱。
- 立即將20 mL裂解液/乙醇混合液轉移至帶收集管的DNA柱中，室溫下> 2,500 x g離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將離心柱重新放回到收集管中。將剩余溶液轉移至DNA柱中，室溫下> 2,500 x g離心5分鐘，倒掉收集管中的廢液，將離心柱重新放回到收集管中。重復直至所有的溶液通過DNA柱。
- 向離心柱中加入10 mL 70% 乙醇，室溫下> 2,500 x g 離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將離心柱重新放回到收集管中。重復步驟“11”。
- 將離心柱放回高速離心機中，室溫下> 2,500 x g開蓋離心10分鐘，以*去除殘留的乙醇。
- 將離心柱轉至一個新的50 mL離心管中，向DNA柱膜的正中加入0.5-1 mL的Endofree Elution Buffer，室溫放置1分鐘，5,000 x g 離心5分鐘，以洗脫質粒DNA。若想提高得率，將50 mL離心管中的洗脫液再加到柱的中間，5,000 x g離心5分鐘以洗脫質粒DNA。
操作流程：  |
更新時間：2013-01-06 
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