從15～50 mL菌液中純化200 μg無內(nèi)毒素質(zhì)粒DNA

1. 質(zhì)粒拷貝數(shù)：純化中低拷貝的質(zhì)粒時(shí)，使用2倍的菌液體積，2倍的Buffer A1,B1,N3,100%乙醇，相同體積的70% 乙醇和Endofree Elution Buffer..
2. 轉(zhuǎn)化菌: 若為-70^oC甘油凍存的菌，請先涂布平板培養(yǎng)后，再重新挑選新的單個(gè)菌落進(jìn)行培養(yǎng)。切勿直接取凍存在4^oC的菌進(jìn)行培養(yǎng)。
3. 柱結(jié)合能力：250 μg。
4. 對富含內(nèi)源核酸酶的宿主菌（endA＋）如HB101, JM101, TG1等，需去核酸酶，請使用產(chǎn)品PD1712。

1. 取50 µL新鮮的菌液接種到15-50 mL （勿超過 50 mL）的LB培養(yǎng)基（含適量抗生素），37^oC震蕩培養(yǎng)14-16小時(shí)。室溫下5,000 x g離心10分鐘，收集菌體，并盡可能的吸去上清。
2. 加入2.5 mL Buffer A1（確保已加入RNase A），用移液器或渦流震蕩確保細(xì)菌沉淀重新懸浮。
3. 加入 2.5 mL Buffer B1, 輕輕地反轉(zhuǎn)5-10 次以混合均勻，然后靜置2-5分鐘至溶液粘稠而澄清。 
4. 加入600 µL Buffer N3, 立即反轉(zhuǎn)5次，用手用力搖晃3-5次充分混勻，此時(shí)出現(xiàn)白色絮狀沉淀。
5. 將裂解液轉(zhuǎn)移至過濾器中，放在一個(gè)15 mL的試管上靜置10分鐘。管中的白色絮狀沉淀浮上來，對準(zhǔn)15 mL的管向下壓，使裂解液盡可能多的通過，有些裂解液可能會殘留在沉淀中。注：靜置10 分鐘時(shí)RNase A將工作，排除RNA污染。
6. 定量吸取離心后的上清液至新的15 mL管中（避免吸起沉淀），加入0.1 倍體積的EndoClean Buffer，混勻后冰浴10分鐘，其間不時(shí)搖勻（若EndoClean Buffer粘稠難吸，可將槍頭剪掉頭后再吸取）。
7. 室溫下（冰浴取出后務(wù)必使溶液溫度恢復(fù)到23^oC以上，否則溶液不分層）13,000 x g離心10分鐘（也可在2,500 x g離心15 min）。此時(shí)溶液分為兩層，上層水相含有質(zhì)粒，下層紅色有機(jī)相含有內(nèi)毒素。
8. 將上層水相轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的15 mL管中，加入3 mL 的Buffer N3及3 mL的100% ethonal，用手用力甩5次以混勻，該混合溶液需要需馬上進(jìn)行過柱吸附操作。
9. 立即轉(zhuǎn)移6.0 mL裂解液至帶收集管的DNA柱中，室溫下> 2,500 x g 離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將離心柱重新放回到收集管中。重復(fù)此步直至所有的溶液通過DNA柱。
10. 可選: 向DNA柱中加入 3.0 mL Buffer KB, 室溫下> 2,500 x g 離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將離心柱重新放回到收集管中。
11. 向離心柱中加入5 mL 70% 乙醇，室溫下> 2,500 x g離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將離心柱重新放回到收集管中。重復(fù)步驟“11”。
12. 將離心柱放回高速離心機(jī)中，室溫下> 2,500 x g開蓋離心10分鐘，以*去除殘留的乙醇。
13. 將離心柱轉(zhuǎn)至一個(gè)新的15 mL離心管中，向DNA柱膜的正中加入0.5 mL的Endofree Elution Buffer，室溫放置1分鐘，> 2,500 x g 離心5分鐘，以洗脫質(zhì)粒DNA。若想提高得率，可用洗脫得到的0.5 mL的Endofree Elution Buffer。 再洗脫一次，收集到新的離心管中。

操作流程：