| 無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒說明：1～15 mL菌液中提取30～70 μg無內(nèi)毒質(zhì)粒DNA 試劑盒組分： | Catalog # | PD1212-01 | | Preps | 50 | | ezBind Columns | 50 | | Buffer A1 | 25 mL | | Buffer B1 | 25 mL | | Buffer N3 | 30 mL | | Buffer KB | 30 mL | | DNA Wash Buffer* | 15 mL | | EndoClean Buffer | 10 mL | | Endofree Eluiton Buffer | 10 mL | | RNase A（20 mg/mL） | 2.5 mg（125µL） | | User Manual | 1 | 保存條件： RNAse A在4℃下可以保存一年，Buffer A1加入RNase A 后4℃保存，其它組分室溫保存。 注意事項： - 質(zhì)?？截悢?shù): 純化中低拷貝的質(zhì)粒時，使用2倍的菌液體積，2倍的Buffer A1,B1,N3,相同體積的Wash Buffer和Endofree Elution Buffer .
- 轉(zhuǎn)化菌: 若為-70oC甘油凍存的菌，請先涂布平板培養(yǎng)后，再重新挑選新的單個菌落進行培養(yǎng)。
- 切勿直接取凍存的菌種進行培養(yǎng)。
操作簡明步驟： - 接種新鮮的單個菌落到3-12 mL的LB培養(yǎng)基 （含適量抗生素），37oC震蕩培養(yǎng)14-16小時。
- 室溫下10,000 x g離心1分鐘，收集菌體，并盡可能的吸去上清。
- 加入450 µL Buffer A1 （確保已加入RNase A），用移液器或渦流震蕩確保菌體充分懸浮。
- 加入 450 µL Buffer B1, 輕輕地反轉(zhuǎn)5-10 次以混合均勻，然后靜置2-5分鐘至溶液粘稠而澄清。
- 加入100 µL Buffer N3, 立即反轉(zhuǎn)5次，用手用力搖晃3-5次充分混勻，此時出現(xiàn)白色絮狀沉淀。
- 將離心管轉(zhuǎn)至高速離心機，在室溫下13,000 rpm離心10分鐘（若上清中仍有白色沉淀，可翻轉(zhuǎn)后再次離心5分鐘）。
- 定量吸取離心后的上清液至新的1.5mL管中，加入0.1 volume的EndoClean Buffer，混勻后冰浴10分鐘，其間不時搖勻（若EndoClean Buffer粘稠難吸，可將槍頭剪掉頭后再吸取）。
- 室溫下（冰浴取出后務(wù)必使溶液溫度恢復到23oC以上，否則溶液不分層，為保證分層效果，可直接在65oC溫育5分鐘）13,000 rpm離心10分鐘。此時溶液分為兩層，上層水相含有質(zhì)粒，下層紅色有機相含有無內(nèi)毒素。
- 將上層水相轉(zhuǎn)移至一個新的2.0 mL管中，加入450 µL的Buffer N3及400 µL的100% ethonal，用手用力甩3次以混勻。
- 將溶液700 µL轉(zhuǎn)移至帶有收集管的DNA柱中，室溫下13,000 rpm 離心20秒，倒掉收集管中的廢液，將離心柱重新放回到收集管中。重復此步驟至全部溶液轉(zhuǎn)移至DNA柱中。
- 可選: 向DNA柱中加入 500 µL Buffer KB, 室溫下13,000 rpm 離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將離心柱重新放回到收集管中。
- 向離心柱中加入650 µL DNA Wash Buffer （確保已加入無水乙醇），室溫下，13,000 rpm 離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將離心柱重新放回到收集管中。重復步驟“12”。
- 將離心柱放回高速離心機中，13,000 rpm室溫下開蓋離心2分鐘，以*去除殘留的乙醇。
- 將離心柱轉(zhuǎn)至一個新的1.5 mL離心管中，向DNA柱的正中間加入50~100 µL （體積>50 µL） 的Endofree Elution Buffer，洗脫質(zhì)粒DNA。將離心管中的洗脫液再次加到DNA柱的正中間，室溫放置1分鐘，13,000 rpm 離心1分鐘，收集洗脫液到同一個離心管中。
操作流程：  |
更新時間：2013-01-06 
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