人外周血淋巴細(xì)胞分離液說明書LTS1077-1
人外周血淋巴細(xì)胞分離液說明書
【包裝規(guī)格】
200ml/瓶
【貨號】
LTS1077-1
【適用儀器】
zui大離心力可達(dá) 1200g 的水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)
【檢驗(yàn)方法】
全過程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行。
通用實(shí)驗(yàn)方法
1、取 2ml 新鮮抗凝血與 2ml 樣本稀釋液（產(chǎn)品編號：2010C1119）混勻。
2、取一支 15ml 離心管，加入 3ml 分離液，用吸管小心吸取稀釋后的血液樣本加于分離液之
液面上，400g，30-40min。
3、離心后，此時離心管中由上至下分為四層。*層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細(xì)胞層。
4、取白環(huán)層，加入 3 倍體積的清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118）混勻，60-100g，離心 10min，棄上清。
5、加 6-8ml 清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118）混勻，60-100g，離心 10min，棄去上清，后
以 0.5ml 后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸目的細(xì)胞。
注：血液樣品量增大時，可通過改變離心管直徑的方法始終保持樣本量高度與分離液高度為
2.4cm 與 3cm，其他分離條件不變。
為滿足客戶實(shí)際使用需求，灝洋根據(jù)不同血液樣本量推薦具體實(shí)驗(yàn)操作方法如下：
一、 使用 15ml 離心管時：
情況 A：血液樣本量小于 3ml 時，實(shí)驗(yàn)方法如下：
1、取一支 15ml 離心管，加入 3ml 分離液。
2、用吸管小心吸取血液樣本加于分離液之液面上，400-650g，離心 20-30min（注：根據(jù)血液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時間越長，具體離心條件需客戶自行摸索，以達(dá)到*分離效果）。
3、離心后，此時離心管中由上至下分為四層。*層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色淋巴
細(xì)胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細(xì)胞層。
4、用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層到另一 15ml 離心管中，向所得離心管中加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118），混勻細(xì)胞。
5、250g，離心 10min。
6、棄上清。
7、用吸管以 5ml 清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118）重懸所得細(xì)胞。
8、250g，離心 10min。
9、重復(fù) 6、7、8，棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。
情況 B：血液樣本量為 3-6ml 時，實(shí)驗(yàn)方法如下：
1、取一支 15ml 離心管，先加入與血液樣本等量的分離液。
2、用吸管小心吸取血液樣本加于分離液之液面上，450-650g，離心 20-30min（注：根據(jù)血液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時間越長，具體離心條件需客戶自行摸索，以達(dá)到*分離效果，但zui大離心力不超過 1200g）。
3、離心后，此時離心管中由上至下分為四層。*層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細(xì)胞層。
4、用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層到另一 15ml 離心管中，向所得離心管中加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118），混勻細(xì)胞。
5、250g，離心 10min。
6、棄上清。
7、用吸管以 5ml 清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118）重懸所得細(xì)胞。
8、250g，離心 10min。
9、重復(fù) 6、7、8，棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。
二、 使用 50ml 離心管時：
情況 A：血液樣本量為 6-10ml 時，實(shí)驗(yàn)方法如下：
1、取一支 50ml 離心管，先加入與血液樣本等量的分離液。
2、用吸管小心吸取血液樣本加于分離液之液面上，500-950g，離心 20-30min（注：根據(jù)血液樣 本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時間越長，具體離心條件需客戶自 行摸索，以達(dá)到*分離效果，但zui大離心力不超過 1200g）。
3、離心后，此時離心管中由上至下分為四層。*層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色淋巴
細(xì)胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細(xì)胞層。
4、用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層到另一 15ml 離心管中，向所得離心管中加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118），混勻細(xì)胞。
5、250g，離心 10min。
6、棄上清。
7、用吸管以 5ml 清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118）重懸所得細(xì)胞。
8、250g，離心 10min。
9重復(fù) 6、7、8，棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。
情況 B：血液樣本量為 10-20ml 時，實(shí)驗(yàn)方法如下：
1、取一支 50ml 離心管，先加入與血液樣本等量的分離液。
2、用吸管小心吸取血液樣本加于分離液之液面上，500-1100g，離心 20-30min（注：根據(jù)血液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時間越長，具體離心條件需客戶自行摸索，以達(dá)到*分離效果，但zui大離心力不超過 1200g）。
3、離心后，此時離心管中由上至下分為四層。*層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細(xì)胞層。
4、用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層到另一 15ml 離心管中，向所得離心管中加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118），混勻細(xì)胞。
5、250g，離心 10min。
6、棄上清。
7、用吸管以 5ml 清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118）重懸所得細(xì)胞。
8、250g，離心 10min。
9、重復(fù) 6、7、8，棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。
【注意事項(xiàng)】
1、全過程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行。為獲得*的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在取血 2h 內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，血液存放時間越長，細(xì)胞分離效果越差。血液放置超過 6h 后分離效果更差甚至不能達(dá)到分離目的。
2、本實(shí)驗(yàn)不要使用高聚合材質(zhì)（如聚苯乙烯）的塑料制品，應(yīng)使用無靜電、低靜電離心管及未經(jīng)堿處理過后的玻璃制品，因?yàn)殪o電作用將導(dǎo)致細(xì)胞貼壁、堿處理的玻璃表面會變成毛面，影響細(xì)胞分離效果。
3、吸取過多的淋巴細(xì)胞層及分離液層會導(dǎo)致分離液交界處的粒細(xì)胞被吸出從而使混雜的粒細(xì)胞數(shù)量增加。
4、吸取過多的淋巴細(xì)胞層上層溶液會導(dǎo)致血漿蛋白及血小板混雜。
5、如所實(shí)驗(yàn)后細(xì)胞得率或活性過低，請?zhí)旖驗(yàn)笠詫で髱椭唧w詳見下方生產(chǎn)企業(yè)信息。
6、當(dāng)血液樣本粘度過高需稀釋時，*稀釋方法：將血液與樣本稀釋液（產(chǎn)品編號：2010C1119）1:1 稀釋混勻備用。注：不當(dāng)?shù)南♂尫椒〞档图?xì)胞得率及活性。如血液樣本經(jīng)過稀釋則分離過程中需適當(dāng)降低離心力和離心時間。
7、因血液樣本的個體差異及血液粘度不同，需調(diào)整離心力及離心時間，離心力zui大不超過
1000g。
【儲存條件及有效期】
常溫保存，有效期 2 年。本品易感染細(xì)菌，需無菌條件操作。無菌條件下操作，啟
封后置常溫保存。如 4℃保存，本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果。
【參考值（參考范圍）】
本實(shí)驗(yàn)淋巴細(xì)胞提取率及純度均大于 80%。
下表為成年人外周血中各種細(xì)胞的數(shù)量及比例，用戶可適當(dāng)進(jìn)行參考。
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| 紅細(xì)胞 |
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| 白細(xì)胞 |
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| 血小板 |
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| （4.0-10.0）×109 |
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| （4.0-5.5）×1012 |
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| （1.0-3.0）×1011 |
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| 含量（個/L） |
| 中性粒細(xì)胞 | 淋巴細(xì)胞 | 單核細(xì)胞 |
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| 50%-70% | 20%-40% |
| 3%-8% |
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| 【灝洋新型離心管*實(shí)驗(yàn)技術(shù)方案】 |
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| 抗凝血液 |
| 稀釋液 |
| 分離液 |
| 離心力 |
| 離心時間 |
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| 15mL 離心管 | 3mL |
| 3mL |
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| 約 4mL |
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| （與隔片持平） |
| 400-500g |
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| 4mL |
| / |
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| （zui大不超過 | 20-30min |
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| 10mL |
| 10mL |
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| 約 15mL |
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| 50mL 離心管 |
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| 1000g） |
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| 15mL |
| / |
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| （與隔片持平） |
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【相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)方案】
1、所獲得淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)。
2、所獲得淋巴細(xì)胞的核酸提取技術(shù)。
3、所獲得淋巴細(xì)胞的鑒定方法、A.流式細(xì)胞技術(shù)B.免疫組化技術(shù)C.原位雜交技術(shù)D.PCR 技術(shù)
【可能存在的問題及解決方法】
1. 由于血液粘度、細(xì)胞密度等差異可能造成的問題及解決方案如下表所示：
出現(xiàn)情況 | 出現(xiàn)原因 | 建議解決方案 |
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離心后目的細(xì)胞存在于血漿層或稀釋液層 | 轉(zhuǎn)速過小或離心時間過短 | 適當(dāng)增減轉(zhuǎn)速 |
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離心后目的細(xì)胞存在于分離液中 | 轉(zhuǎn)速過大或離心時間過長 |
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離心后白環(huán)層彌散 | 細(xì)胞密度過大 | 調(diào)整細(xì)胞密度 |
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離心后白環(huán)層太淺或看不見 | 細(xì)胞密度過小 |
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- 本分離液分離細(xì)胞的原理為密度梯度離心，其密度與溫度、大氣壓等密切相關(guān)。不同地區(qū)客戶可根據(jù)當(dāng)?shù)厍闆r對離心條件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。建議對離心條件進(jìn)行調(diào)整時，恒定離心時間，對離心轉(zhuǎn)速進(jìn)行調(diào)整。
- 本分離液依照標(biāo)準(zhǔn)，全部使用藥用級原料，性能指標(biāo)與國產(chǎn)同類產(chǎn)品略有不同，可能出現(xiàn)紅細(xì)胞沉降不*的情況，可以適當(dāng)加大離心轉(zhuǎn)速。
注：在對離心條件進(jìn)行調(diào)整時，離心轉(zhuǎn)速的加減以 50-100g 為基數(shù)，直至達(dá)到*分離效果，離心力zui小不得小于 400g，zui大不得大于 1200g。離心時間以 20-30min 為準(zhǔn)。
